Revista-Asma-2022-03

Fernández Peralbo MA. Rev Asma. 2022;7(1):15-20

Métodos directos para medir la adhesión a corticoides inhalados en asma


Autora

María Auxiliadora Fernández Peralbo

Correspondencia

María Auxiliadora Fernández Peralbo
Biomedal S.L. 41900 Camas (Sevilla), España
E-mail: auxi.fernandez@biomedal.com

Resumen

Medir la adhesión a los glucocorticoides (GCIs) presenta sus propios desafíos y actualmente no hay forma de medirla directamente, por lo que distinguir al paciente cumplidor del enfermo con pobre adhesión al tratamiento supone todo un reto. El desarrollo de métodos directos, simples y objetivos para cuantificar metabolitos de GCIs en biofluidos con toma de muestra mínimamente invasiva en asmáticos, y su relación con otros métodos indirectos disponibles, se marca como un reto necesario para el control de la enfermedad. En este sentido, el desarrollo en las últimas décadas de tecnología analítica avanzada ha supuesto un salto de calidad. Las técnicas más usadas en la cuantificación directa de GCIs en muestras biológicas son la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS/MS) y los inmunoensayos (IA) basados tanto en enzimas como en la medición del grado de polarización de fluorescencia.

Introducción

En el asma, los glucocorticoides inhalados (GCIs) constituyen la base del tratamiento1-2; sin embargo, se estima que la adhesión al tratamiento tiende a ser muy deficiente, entre el 30% y el 70%3. Existe la necesidad de herramientas para valorar la adhesión al tratamiento y evaluarla periódicamente, ayudando a tomar decisiones en cuanto a las intervenciones más apropiadas para cada paciente.

Hay infinidad de motivos que provocan la falta de adhesión, pero primeramente debemos detectarla con fiabilidad para que, con ayuda de otras metodologías, se pueda determinar su causa e intentar corregirla. Tener una mala ejecución en la técnica de inhalación es uno de los motivos más frecuentes, sobre todo en pacientes de avanzada edad, lo que resulta en una pobre adhesión de forma involuntaria.

Los métodos indirectos para medir la adhesión basados en cuestionarios, recuento de dosis, empleo de dispositivos electrónicos o control de las tasas de renovación de recetas son relativamente fáciles de realizar y son los más utilizados4, pero no siempre brindan la información requerida, ya que solo son fiables cuando el paciente se confiesa incumplidor.

Existe, por tanto, una clara necesidad de desarrollar métodos directos basados en la cuantificación de un fármaco y/o de sus metabolitos o sustancias trazadoras en algún fluido biológico (sangre, orina, saliva) o en el pelo del paciente.

Es evidente que los métodos directos de cuantificación de fármacos en muestras biológicas se aproximan al método perfecto para valorar el cumplimiento. Sin embargo, en asma están poco desarrollados, pueden producir resultados limitados al referirse a la última dosis tomada y la concentración puede variar por interacción con otros fármacos o por variaciones metabólicas genéticas. Además, pueden detectarse falsos adherentes, ya que el sujeto al saberse vigilado puede realizar una mejor cumplimentación y sobreestimarse la adhesión.

Las técnicas más usadas en la cuantificación directa de GCIs en muestras biológicas son la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (en inglés, LC-MS/MS) y los inmunoensayos (en inglés, IA).

Los IA se utilizan comúnmente para medir esteroides, aunque no sin limitaciones. La reactividad cruzada reduce la especificidad y puede causar una sobreestimación de la concentración real de esteroides5. Los epítopos limitados, los efectos de la matriz, la interferencia de anticuerpos heterófilos y la falta de estandarización de los IA son preocupaciones adicionales para la confiabilidad de los resultados por IA5. El uso de LC-MS/MS ha demostrado una mayor sensibilidad analítica y especificidad en la medición de esteroides en comparación con IA y ha surgido como el método más preciso para medir moléculas pequeñas6-8. La amplia aplicación de LC-MS/MS para la cuantificación de corticoides en estudios de control antidopaje9-11 pone de manifiesto su utilidad en el control del asma.

En cuanto a la determinación de los niveles de GCIs en muestras biológicas, cabe destacar que puede haber variabilidad interindividual debido a diferencias en la absorción, distribución o eliminación de los fármacos. Por ello, la obtención de unos niveles infra- o supraterapéuticos de un determinado medicamento no puede atribuirse de forma inequívoca a una adhesión inadecuada. Por otra parte, si un fármaco tiene una semivida corta, la determinación de su concentración no permitiría detectar la “adhesión de bata blanca”, esto es, cuando el paciente toma la medicación de forma correcta poco antes de la visita médica pero vuelve a dejarla después de la visita de seguimiento12. Por consiguiente, la determinación bioquímica del fármaco o un marcador puede informarnos de si el paciente tomó recientemente una dosis, pero la información puede ser simplista en cuanto a la adhesión al tratamiento.

Muestras biológicas para la monitorización de GCIs

A la hora de elegir un tipo de muestra biológica para realizar estudios de adhesión a un determinado tratamiento, es importante tener en cuenta factores como el metabolismo del fármaco, la estructura química en la que se excreta y la facilidad del muestreo, entre otros. Además, es necesario hacerse las siguientes preguntas: ¿Contiene la matriz biológica el fármaco objetivo o algún metabolito? ¿El tamaño de la muestra biológica disponible contiene suficiente fármaco o metabolito diana para ser detectado? ¿Cuál es la estabilidad de los analitos en esa matriz y su complejidad (tratamiento de la muestra)? ¿Hay métodos analíticos validados disponibles o se pueden desarrollar?

La disponibilidad de técnicas analíticas que detecten y cuantifiquen niveles de concentración de GCIs que sean acordes con el rango presente en dichas muestras, junto con un procesamiento de la muestra lo más simple posible, juegan un papel crucial a la hora de obtener resultados satisfactorios en su determinación.

En la actualidad, los métodos más ampliamente desarrollados para la cuantificación de GCIs se basan en el uso de LC-MS/MS en orina11,13-15 y en suero/plasma sanguíneo16-20. Los inconvenientes de coste y necesidad de formación en este tipo de técnica hacen que sea necesario el desarrollo y la implantación de metodologías más sencillas, baratas y rápidas para un control de la adhesión más dinámico en la consulta médica.

Métodos por LC-MS/MS para cuantificar GCIs

La alta selectividad y sensibilidad que ofrecen los métodos de análisis cuantitativo de fármacos a bajas concentraciones extraídos de matrices biológicas complejas basados ​​en LC-MS/MS, hace que se usen en estudios farmacocinéticos, identificación de metabolitos en plasma y orina, análisis de dopaje y estudios forenses.

El propionato de fluticasona (FP), la budesónida (BUD) y el dipropionato de beclometasona (BDP) forman parte de los GCIs más ampliamente usados para tratar el asma. En la bibliografía existen métodos para la cuantificación de estos GCIs usando LC-MS/MS en orina14-15, en suero, en plasma sanguíneo16-17 e incluso en pelo21. Sin embargo, la elección de cabello humano como muestra para este tipo de análisis ha reportado límites de cuantificación muy altos. Orina y sangre son las muestras más ampliamente seleccionadas para la cuantificación de GCIs, siendo la orina la muestra biológica preferida para estos ensayos, debido a la amplia ventana de detección disponible como resultado de la farmacocinética de los metabolitos del fármaco.

El uso de suero como muestra para control de adhesión en asmáticos tras inhalar GCIs se llevó a cabo en un estudio, piloto primeramente17, en la Universidad de Manchester, y recientemente se han publicado resultados con mayor población por los mismos investigadores16. El objetivo principal del estudio piloto fue determinar si los GCIs FP y BUD se podían medir directamente en suero utilizando LC-MS/MS y si esto podría usarse como marcador de adhesión. Se reclutó a 19 pacientes, de los cuales 13 estaban tomando una dosis estable de FP inhalado y 6 de BUD. Se les tomó una muestra de sangre preinhalación y cuatro muestras más tras 1, 2, 4 y 8 horas postinhalación observada. Los niveles de concentración sérica se detectaron con éxito en 18 de los 19 pacientes, detectándose incluso por encima del límite de detección para BUD después de 8 horas en todos los pacientes, y para FP en 8 de 13 pacientes. Se observó que 2 pacientes tenían una técnica de inhalación claramente inadecuada, coincidiendo con las concentraciones séricas más bajas de FP (concentraciones máximas de 27 y 32 ng/L). Hubo gran variabilidad en los niveles basales del fármaco en suero, incluidos algunos en los que el fármaco era indetectable. La baja adhesión se definió como la recolección de menos del 80% de las prescripciones esperadas en los 6 meses anteriores. De 10 pacientes con niveles basales indetectables del fármaco, 2 eran aquellos con una técnica de inhalación claramente deficiente y otros 6 tenían baja adhesión. No es posible determinar a partir de los datos si esto se debió a una mala adhesión previa o si los niveles de concentración sérica caen por debajo de los niveles detectables entre las dosis diarias, o incluso a ambos motivos a la vez.

En el estudio a mayor escala, teniendo como base el piloto, se reclutó a 60 pacientes con asma grave, encontrando en el 47% (n = 28) de los casos una pobre adhesión (basada en tasas de reabastecimiento de prescripciones < 80% dentro de los últimos 12 meses). La FP inhalada fue la más utilizada (43%), mientras que el 23%, el 15%, el 11% y el 8% de los pacientes tenían prescrito BDP, BUD, ciclesonida (CIC) y furoato de fluticasona (FF), respectivamente. Se observó a los pacientes utilizando su dosis habitual matutina de GCIs y se evaluó la técnica. Cuando la técnica de inhalación se consideró inadecuada, se dieron instrucciones y se pidió al participante que hiciera una nueva inhalación con una nueva dosis. Ocho horas tras la inhalación, todos los pacientes que usaban budesónida (10) y dipropionato de beclometasona (15), y todos menos uno de los que estaban usando FP (28), tenían niveles detectables del fármaco en suero, mostrando la concentración máxima entre 1 y 2 horas tras la inhalación. Por el contrario, no se detectó CIC o FF de manera confiable en las muestras, salvo en 2 pacientes de 4 que tomaban FF y en los 7 que tomaban CIC, aunque el número de participantes en estos casos fue muy bajo.

A pesar de que las dosis administradas de FP fueron las mayores, se detectaron niveles máximos del fármaco hasta seis veces menores que de BUD y BDP. Esto se puede explicar por las diferentes farmacocinéticas de cada fármaco relacionadas con las propiedades químicas de los mismos. Es probable que las principales fuentes de variación en la farmacocinética en este estudio sean la deposición (pulmonar frente a orofaríngea), la biodisponibilidad oral (la fracción de fármaco que no se metaboliza completamente en el primer paso a través de la circulación hepática), la lipofilicidad (y, por lo tanto, el tiempo de residencia pulmonar) y el volumen de distribución. Las tasas de detección más altas de BUD y BDP que se detectaron fueron probablemente consecuencia de la interacción entre varios de estos factores. Las biodisponibilidades orales de FP, CIC y FF son igualmente bajas (< 1%), mientras que las de BUD y BDP son mucho más altas (11% y 15%, respectivamente), lo que significa que más fármaco puede ingresar en la circulación sin cambios a través de esta ruta. Por otro lado, el FF y el FP tienen una mayor lipofilicidad y un tiempo de residencia pulmonar más prolongado que la BUD y la BDP y, por lo tanto, tendrán una menor biodisponibilidad sistémica.

Al inicio del estudio, normalmente de 10 a 12 horas después de la dosis anterior y antes de presenciar la administración de los GCIs, se detectó FP sérico en 21 participantes (78%). Dos de los 4 sujetos con baja adhesión que tomaban BUD tenían un nivel indetectable al inicio del estudio. De los 4 pacientes que tomaban FF, no se detectaron niveles séricos en ninguno al inicio del estudio pero sí en 2 después de 8 horas. Los 4 pacientes tenían una buena técnica de inhalación; sin embargo, 2 recogieron menos del 80% de las recetas. Se pudo detectar FF a tiempos posteriores, pero no de manera confiable, probablemente debido a sus propiedades farmacocinéticas y a la dosis diaria total relativamente baja de 184 mg. El CIC tiene una vida media plasmática relativamente corta, por lo que no se detectó en ninguna muestra más allá de las 2 horas posteriores a la dosis.

Podemos concluir que los GCIs de uso común (BUD, BDP y potencialmente FP) pueden detectarse de manera confiable en la sangre al menos 8 horas después de la dosificación y usarse como una medida de adhesión en el asma grave. Sin embargo, un resultado positivo confirma solo la adhesión a corto plazo. A más largo plazo se requeriría información adicional, obtenida, por ejemplo, al contar el reabastecimiento de recetas.

Nuevas metodologías se deberían seguir desarrollando para reducir los límites de detección y cuantificación y para detectar concentraciones más bajas con mayor precisión (en caso de dosis administradas menores) y quizás más allá de las 8 horas postinhalación. Además, en futuros estudios se debería evaluar la capacidad de las pruebas puntuales “aleatorias” para detectar la adhesión en la práctica real y comparar con la detección de GCIs en otras muestras, como orina.

El FP nativo absorbido por el tracto gastrointestinal (< 1% de la FP total) se metaboliza rápidamente por la isoforma 3A4 del citocromo P450 (CYP3A4) para producir el ácido 17 beta carboxílico del propionato de fluticasona (FP17βCA), que es farmacológicamente inactivo y tiene una mayor solubilidad en agua, excretándose en la orina22,23. En consecuencia, un método preciso y sensible para medir FP17βCA en orina puede proporcionar una alternativa óptima y no invasiva al plasma para monitorear el cumplimiento/incumplimiento del paciente con la terapia de FP inhalado.

De hecho, las publicaciones que hay sobre el uso de orina para estudios de adhesión a GCIs son los que arrojan resultados más prometedores ante la problemática actual. Sin embargo, al no haberse planteado el uso de enzimas para la hidrolisis de metabolitos conjugados, es posible que se estén infraestimando los resultados obtenidos. Por ello, existe un frente abierto para estudiar en profundidad las estructuras moleculares en las que predominantemente se excretan los metabolitos de GCIs en orina.

La detección de FP17βCA en muestras de orina aleatorias de sujetos humanos que reciben tratamiento de FP a dosis bajas respalda la utilidad clínica de medir FP17βCA en orina para controlar el cumplimiento del paciente. Hagan et al. diseñaron un estudio15 para evaluar el análisis urinario de FP17βCA como prueba para verificar si un paciente específico ha tomado o no FP dentro de las 16-24 horas tras la administración. La orina de 30 sujetos asmáticos se analizó durante las 16-24 horas después de la administración presenciada de dos dosis inhaladas de 110 µg de FP inhalado utilizando LC-MS/MS con un LOQ de 10,3 pg/mL. Se detectó FP17βCA en la orina de los 30 asmáticos, en un rango de 12,4-3.290,0 pg/mL, y fue indetectable en 30 sujetos de control que no tomaron el medicamento. Por tanto, el análisis de FP17βCA en orina proporciona un método sensible que puede usarse para verificar que un paciente específico puede no haberse administrado FP dentro de una ventana de 16 a 24 horas antes de la prueba.

En otro estudio, realizado en el laboratorio del departamento de Medicina y Patología de Rochester (EE.UU.)14, se desarrolló también un método por LC-MS/MS para cuantificar FP17βCA en orina, con un rango lineal de 10,3 a 9.510 pg/mL. Dicho método lo aplicaron para evaluar la eliminación de FP inhalado en muestras de orina aleatorias que se recolectaron diariamente de 4 sujetos durante 14 días. Los sujetos recolectaron muestras de orina diarias antes del inicio de la terapia de FP (días 1 y 2), durante los días de administración de la terapia de FP en dosis bajas (220 μg de FP por día) (día 2, después de la administración de FP, y días 3-5) y días después del cese de la terapia de FP (días 6 a 14). El metabolito FP17βCA estuvo ausente en los sujetos antes de la terapia de FP (días 1 y 2), se detectó después de una dosis de FP (día 3) con concentraciones entre 541 y 1450 pg/mL. Estos niveles permanecieron elevados durante todo el período de dosificación, volviendo a niveles indetectables 6 días después del cese de la terapia (días 11-14).

La ventana de detección de FP17βCA en orina (hasta 6 días) proporciona un período de tiempo suficiente para realizar pruebas aleatorias del cumplimiento de la terapia de FP, en comparación con la prueba de FP en plasma, que tiene una ventana de detección limitada (≤ 12 h). Por lo tanto, una concentración de FP17βCA por debajo del LOQ indica que es posible que el paciente no se haya administrado la terapia de FP inhalada en los 6 días anteriores. Sin embargo, se necesitan más estudios para establecer rangos terapéuticos de FP17βCA a fin de que los valores cuantitativos sean útiles en la identificación de pacientes que usan en exceso o erráticamente la terapia con FP.

Inmunométodos para cuantificar GCIs

Los IA se basan en la interacción del analito con un anticuerpo que lo reconoce con una elevada afinidad y especificidad. En general, son métodos simples y fáciles de usar, que no requieren instrumentación tan sofisticada como los métodos cromatográficos, por lo que su coste es menor. Los dos métodos más utilizados en laboratorios de análisis son el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (sigla en inglés, ELISA) y el inmunoensayo de flujo lateral (sigla en inglés, LFIA). El ELISA se realiza en placas multipocillos y requiere el uso de un lector de microplacas para su cuantificación, mientras que el LFIA puede ser cuantificado con pequeños lectores portátiles. Hasta la fecha, el ELISA es el método más utilizado, pero el número de LFIA aumenta gracias al desarrollo experimentado en los últimos años24 y a la posibilidad de uso en los puntos de atención.

Debido al pequeño tamaño molecular de los corticoides, el tipo de ELISA más común para su detección es el ELISA competitivo25, ya que por impedimentos estéricos solo pueden unirse a una molécula de anticuerpo. En este ensayo los anticuerpos tapizan la superficie del pocillo. El analito presente en la muestra compite con analito conjugado a una enzima, normalmente la peroxidasa de rábano, que permite su detección en presencia de su sustrato. En este ensayo la señal es inversamente proporcional a la cantidad de corticoide presente en la muestra. Uno de los primeros ELISA desarrollados para la detección de glucocorticoides en particular, budesónida, detecta una concentración de 10 pM en plasma25. El ensayo requiere un pretratamiento de varios pasos, que separa otros compuestos estructuralmente similares evitando reactividad cruzada. Este pretratamiento también separa los metabolitos derivados de la budesónida. Sin embargo, la precisión a bajas concentraciones de budesónida es demasiado baja.

En el mercado existen kits ELISA capaces de detectar distintos glucocorticoides con diferentes límites de detección y reactividad cruzada, es decir, la capacidad de detectar varios glucocorticoides con el mismo anticuerpo (Neogen Corporation, Randox Food Diagnostics, R-Biopharm Nederland, Tecna SRL). Los glucocorticoides detectados con mayor sensibilidad por kits comerciales son la dexametasona y la flumetasona. La dexametasona presenta un límite de detección en orina de 0,25-3 ng/mL (Tecna SRL, Randox Food Diagnostics, R-Biopharm Nederland).

La reactividad cruzada es alta entre dexametasona, flumetasona y betametasona, aunque varía según el kit. La metilprednisolona y su metabolito metilprednisolona-21-hemisuccinato se puede detectar con un I-50 de 1,7 y 1,5 ng/mL en tampón de reacción, respectivamente, con una reactividad cruzada frente a otros glucocorticoides prácticamente despreciable (Methylprednisolone Forensic ELISA Kit, Neogen Corporation). El kit de detección de acetónido de triamcinolona (IC50 de 0,3 ng/mL, Triamcinolone Acetonide Forensic ELISA Kit, Neogen Corporation) también permite la detección de fluocinonida, acetónido de fluocinonida, amcinonida, flunisolida, halcinonida y budesónida (IC50 de 0,3, 0,45, 0,7, 1,4, 1,5 y 5,4 ng/mL, respectivamente).

La prednisolona es el glucocorticoide para el que existen más kits de detección ELISA en el mercado (LifeSpan BioSciences Inc., MyBiosource, BioConnect, Antibodies-online GmbH, Alpha Diagnostic Intl. Inc., Creative Diagnostics, etc.), muchos de ellos orientados al control de calidad en la producción animal, mientras que otros tienen como objetivo la detección de dopaje en deportistas y animales de competición. Su detección en suero y plasma varía entre 0,3 y 5 ng/mL y no presenta reactividad cruzada significativa en kits comerciales y baja en el ELISA desarrollado por Kumar26.

Un test LFIA consiste en una tira de material poroso que incorpora distintos elementos de reconocimiento del analito y señalización de su presencia, libres o inmovilizados en zonas concretas de dicha tira, que se activan con el flujo de la muestra a lo largo de la misma. La inmunocromatografía combina, por tanto, las ventajas del principio de inmunodetección en el ensayo ELISA con las de la cromatografía convencional. Los ensayos se han expandido rápidamente a diversos campos desde la aparición del primer LFIA para análisis de glucosa en orina27, siendo el test de embarazo28 y los test de detección de COVID-19 los ejemplos más conocidos. Existen test LFIA para detectar el glucocorticoide endógeno cortisol desde 200329. Estos se han utilizado, por ejemplo, en estudios de estrés con muestras de saliva recogidas cada día durante cuatro semanas30. Al ser un ensayo cuantitativo permite observar fluctuaciones de cortisol en un rango de 1 a 70 ng/mL y correlacionarlas con autoevaluaciones de estrés emocional.

En relación con los GCIs, se ha desarrollado un test LFIA para detectar dexametasona en mascarillas faciales que tiene una reactividad cruzada con la prednisolona del 124% y un IC50 para este compuesto de 2,77 ng/mL31. En ausencia de dexametasona, se podría usar este test para determinar la presencia de prednisolona por LFIA.

Una de las limitaciones principales en el desarrollo de IA frente a GCIs es la generación de anticuerpos que reconozcan estos metabolitos. En la búsqueda tradicional de anticuerpos, por inmunización animal y extracción de suero, el pequeño tamaño de los GCIs impide que sean reconocidos por el sistema inmune del animal hospedador. Como alternativa, los GCIs se conjugan a proteínas, como por ejemplo la albúmina de suero fetal bovino (en inglés, BSA), para fomentar su capacidad inmunogénica26,31. Por otro lado, la baja solubilidad en agua de estos compuestos crea dificultades en el desarrollo de metodologías ELISA. La posibilidad de conjugar estos fármacos a compuestos de tipo glucurónido para aumentar su polaridad (más presentes como conjugados en orina) abre un nuevo campo para desarrollar métodos más selectivos y sensibles.

Por tanto, los IA, específicamente los dispositivos LFIA, pueden ser una herramienta para el seguimiento de la adhesión a los GCIs de más amplio uso en pacientes asmáticos atendidos habitualmente en consulta especializada. Sin embargo, será necesario desarrollar anticuerpos capaces de detectarlos de manera sensible y específica, ya que hasta donde sabemos solo cumplen estos requisitos los anticuerpos frente a la prednisolona y el acetónido de triamcinolona. Incluso en estos casos, sería necesario llevar a cabo un estudio clínico para validar esta aplicación.

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